การโคลนยีน
การตัดและเชื่อมต่อสายดีเอ็นเอเป็น DNA สายผสมนั้นไม่เพียงพอที่จะสามารถนำไปประยุกต์ใช้ได้ แต่ยังต้องมีวิธีการที่จะสามารถดำรง DNA สายผสมให้คงอยู่ และเพิ่มจำนวนเพื่อใช้ในการศึกษาว่า สาย DNA เหล่านั้นควบคุมการสร้างโปรตีนชนิดใดและศึกษาว่า DNA มียีนอะไรบ้าง สิ่งที่จำเป็นคือจะต้องเพิ่มจำนวน DNA ในบริเวณดังกล่าวให้มากพอที่จะศึกษาได้ การเพิ่มจำนวนของ DNA ที่เหมือน ๆ กันนั้นเรียกว่า การโคลนดีเอ็นเอ (DNA cloning) และหาก DNA บริเวณดังกล่าวเป็นยีน ก็อาจเรียกว่า การโคลนยีน (gene cloning)
การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรีย
การโคลนยีนวิธีหนึ่งที่เป็นที่นิยมกัน คือ อาศัยวิธีการเพิ่มจำนวนชุดของ DNA ในพลาสมิด (plasmid) ของแบคทีเรีย ซึ่งถือว่าเป็น DNA พาหะ (vector) สำหรับการโคลน DNA อย่างหนึ่งในแบคทีเรีย 1 เซลล์ อาจมีพลาสมิด 1 ถึง 300 ชุด เมื่อนำเซลล์แบคทีเรียไปเลี้ยงเพื่อเพิ่มจำนวน ชุดของพลาสมิดก็จะเพิ่มขึ้นด้วย ซึ่งสาวนของ DNA ที่ต้องการที่แทรกไวในพลาสมิด ก็จะเพิ่มขึ้นตามโดยปริยาย หากส่วนของ DNA ที่แทรกไว้เป็นยีนก็อาจนำไปใช้ประโยชน์ต่อไป
สิ่งที่ต้องใช้ในการทดลอง คือ 1. DNA แม่แบบ (DNA template)ซึ่งเป็น DNA ที่ต้องการโคลนหรือเพิ่มจำนวน 2. DNA ไพรเมอร์ (DNA primer) เป็น DNAสายสั้นๆ ที่ใช้เกาะกับ DNA ที่ต้องการโคลนเพื่อเป็นจุดเรื่มต้นในการสังเคราะห์สายDNA 3. นิวคลีโอไทด์ทั้ง 4 ชนิด ประกอบด้วย dATP (A) , dGTP (G) , dCTP (C) และ dTTP (T) 4. เอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส ชนิดพิเศษ
ขั้นตอนของการทำงานของเครื่องเทอร์มอไซเคลอร์ โดยใช้เทคนิค PCR 1. ขั้นตอนแรกนี้เรียกว่า “Denaturation” เพิ่มอุณหภูมิของเครื่องให้สูงขึ้นจนสาย DNA สายคู่ที่เป็นแม่แบบแยกออกจากกันเป็นสายเดี่ยว(ขั้นนี้อุณหภูมิประมาณ 90 ◦) 2. ขั้นตอนที่สองเรียกว่า “Annealing” ลดอุณหภูมิลง (เหลือประมาณ 55 ◦) จะทำให้ DNA ไพรเมอร์จับกับ DNA แม่แบบสายเดี่ยวแต่ละสายในตำแหน่งที่เป็นจุดเริ่มต้นในการสังเคราะห์ DNA ด้วยพันธะไฮโดรเจน 3. ขั้นตอนที่สามเรียกว่า “Extension” ปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส เพื่อให้สร้างสาย DNA สายคู่เพิ่มขึ้น(ช่วงอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์DNA พอลิเมอเรส คือ ประมาณ 72 ◦-75 ◦) 4. เริ่มกระบวนการในขั้นที่1 ใหม่จะได้ DNA สายคู่ 2 สาย เพิ่มเป็น 4 สายคู่ 8 สายคู่ และ 16 สายคู่ ตามลำดับไปเรื่อยๆ จนมากพอกับความต้องการ
จะเห็นได้ว่าเทคนิคPCR นี้จะเพิ่มปริมาณ DNA ที่ต้องการที่มีปริมาณน้อยให้มากได้อย่างรวดเร็ว แต่อย่างไรก็ตามเทคนิค PCR ยังมีข้อจำกัดอยู่ คือ ขั้นตอนการแสดงของยีน เช่น การสร้างโปรตีนและขั้นตอนการตรวจสอบความผิดพลาดของ DNA ที่สร้างขึ้น เนื่องจากเอนไซม์ที่ใช้ในปฏิกิริยานี้บางชนิดไม่มีการตรวจสอบลำดับนิวคลีโอไทด์ของ DNA เหมือนในระบบของเซลล์สิ่งมีชีวิต
